Wykupienie dostępu pozwoli Ci czytać artykuły wysokiej jakości i wspierać niezależne dziennikarstwo w wymagających dla wydawców czasach. Rośnij z nami! Pełna oferta →
29 grudnia 1959 r. podczas spotkania Amerykańskiego Towarzystwa Fizycznego jeden z najwybitniejszych fizyków XX w., Richard Feynman, wygłosił wykład pt. „There’s plenty of room at the bottom” – w wolnym tłumaczeniu: „Jest wiele do odkrycia w głębi (w mikroświecie)”. Stwierdził wówczas m.in., że „bardzo łatwo jest odpowiedzieć na wiele fundamentalnych pytań biologii: wystarczy po prostu dobrze się przyjrzeć!”. Feynman odnosił się głównie do ograniczeń nowej techniki – mikroskopii elektronowej – jednak wielu fizyków odczytało jego wykład również jako apel – a może i proroctwo? – o podjęcie prac nad narzędziami, które pozwolą lepiej się przyjrzeć rzeczom małym.
Spojrzeć inaczej
Od początku XVII w. badacze dysponują mikroskopami optycznymi, które pozwoliły zajrzeć w głąb mikroświata – tkanek, komórek, bakterii. Ale mikroskop optyczny podlega fundamentalnemu ograniczeniu, wynikającemu z falowej natury światła. To tzw. ograniczenie dyfrakcyjne rozdzielczości związane jest z długością fali światła – w zakresie widzialnym rzędu pół mikrometra. Jeśli oglądane obiekty znajdują się bliżej siebie, nie można ich rozróżnić.
Tegorocznym Noblem z chemii, ku zaskoczeniu wielu (przede wszystkim chemików), podzielili się dwaj Amerykanie: Eric Betzig i William E. Moerner, oraz Niemiec – Stefan Hell. Ten ostatni urodził się w 1962 r. w Arad na zachodzie Rumunii. W 1978 r. wraz z całą rodziną, mającą niemieckie korzenie, przeniósł się do RFN. Karierę naukową rozpoczął na Uniwersytecie w Heidelbergu, gdzie obronił doktorat w 1990 r. Zajmował się wówczas obrazowaniem mikrostruktur półprzewodnikowych przy pomocy mikroskopii konfokalnej. Jak wspominał w jednym z wywiadów, już wtedy zadał sobie pytanie: „Czy tak stara i szeroko opisana dziedzina nauki, jak mikroskopia optyczna, pozwala jeszcze na odkrycie czegoś nowego?”.
Odpowiedź była jedna: pokonanie ograniczenia dyfrakcyjnego.
W latach 90. fizycy przesunęli nieco granice rozdzielczości obrazowania optycznego przy pomocy kilku sztuczek: np. mikroskopii dwufotonowej czy tzw. mikroskopii 4π (wynalezionej przez Hella, gdy pracował w Europejskim Laboratorium Biologii Molekularnej w Heidelbergu). Postęp dokonał się również za sprawą tzw. technik mikroskopii bliskiego pola: zamiast ogniskować światło przy pomocy obiektywu mikroskopowego, doprowadza się je do badanego obiektu przez światłowód zakończony stożkowym przewężeniem. Przesuwanie czubka światłowodu bardzo blisko badanej próbki pozwala uzyskać znacząco lepszą rozdzielczość, ale tylko na powierzchni oglądanego obiektu.
Już w latach 30. XX w. pojawił się też mikroskop elektronowy, w którym zamiast światła stosuje się zogniskowaną wiązkę elektronów. Tu także obowiązuje ograniczenie dyfrakcyjne, jednak długość fali elektronów przy stosowanych zwykle energiach jest na tyle mała, że pozwala uzyskać rozdzielczości wystarczające do oglądania kształtu cząsteczek albo ułożenia atomów w kryształach. Ale żywe komórki czy organizmy można przy jej pomocy podglądać tylko w bardzo ograniczonym zakresie: preparat musi być umieszczony w próżni, a na domiar złego wysokoenergetyczne elektrony niszczą oglądane struktury.
Kluczem do sukcesu było to, że Hell potrafił spojrzeć na ograniczenie rozdzielczości mikroskopu inaczej, niż patrzono dotąd: zamiast zajmować się optyką, czyli ogniskowaniem światła przez wyrafinowane układy obiektywów, uznał on, że odpowiedzi należy szukać w innych procesach fizycznych – w mechanice kwantowej, która opisuje, w jaki sposób światło oddziałuje z materią, w szczególności z używanymi w mikroskopii cząsteczkami barwników.
Wyłączanie światła
We współczesnym laboratorium, np. biologii molekularnej, do rzadkości należy widok pochylonego nad okularem mikroskopu badacza. Obrazy są zbierane przez czułe, wysokorozdzielcze kamery bądź inne detektory światła i przetwarzane na ekranie komputera. Co więcej, by poznać budowę bądź funkcje komórek, stosuje się mikroskopię fluorescencyjną, w której badany obiekt jest najpierw zabarwiany tak, że różne jego części, po oświetleniu laserem, odświecają w różnych kolorach.
Pytanie w nowym ujęciu niemieckiego badacza brzmiało więc nie: „jak wprost pokonać ograniczenie dyfrakcyjne?”, lecz: „jak z większą rozdzielczością obrazować świecące cząsteczki barwników?”. I – jak to często w nauce bywa – takie postawienie problemu było już połową drogi do przełomu.
Dla uzyskania wysokiej rozdzielczości w pomyśle Hella kluczowe jest wykorzystanie faktu, że świecenie cząsteczek można nie tylko „włączać”, pobudzając je światłem laserowym, ale również „wyłączać” wiązką lasera o innej barwie. W typowej mikroskopii fluorescencyjnej cząsteczki barwników z całego oświetlanego obszaru po pobudzeniu spontanicznie emitują światło, które, zbierane przez detektor punkt po punkcie, służy do tworzenia obrazu preparatu. Rozdzielczość obrazowania jest bezpośrednio związana z tym, jak mały obszar można oświetlić, co z kolei wynika z praw optyki falowej. Jeśli jednak nie pozwoli się cząsteczkom na swobodną ewolucję, ale po krótkim czasie oświetli się je drugim, silnym, odpowiednio dostrojonym impulsem z lasera, część z nich może zostać zmuszona do szybszego wyświecenia i w efekcie zdezaktywowana, czyli wyłączona z dalszego świecenia. Zmniejsza to tym samym efektywnie wielkość obszaru, z którego pochodzi pozostała, niewygaszona fluorescencja. To zaś skutkuje zwiększeniem rozdzielczości obrazów.
Za wyłączanie świecenia odpowiada proces emisji wymuszonej: ten sam, który leży u podstaw działania lasera [więcej o laserach autor pisał w „TP” 23/2009, czytaj na stronie powszech.net/laser – red.]. Stąd nazwa nowej techniki: STED, Stimulated Emission Depletion, czyli „wyłączanie” dzięki emisji wymuszonej.
Pierwsza publikacja przedstawiająca koncepcję „przełamania bariery ograniczenia dyfrakcyjnego przy pomocy emisji wymuszonej” ukazała się w czerwcu 1994 r., kiedy Hell pracował na Uniwersytecie w Turku w Finlandii. Po krótkim pobycie w Oksfordzie założył on w 1997 r. własną grupę badawczą w Instytucie Maxa Plancka w Getyndze, którego od 2002 r. do dziś jest również dyrektorem.
Już w 2007 r. firma Leica, jeden z wiodących producentów mikroskopów optycznych na świecie, wypuściła na rynek układ mikroskopu w technologii STED. Dziś każdy, kto gotów jest zapłacić 3 mln zł za podstawową konfigurację urządzenia, może zgłębiać tajemnice mikroświata z super- rozdzielczością.
Gdzie wzrok nie sięga
Jak każda metoda obrazowania, również mikroskopia STED ma swoje ograniczenia. Wynikają one m.in. z konieczności użycia silnych, zogniskowanych wiązek laserowych – przy dużych natężeniach światła preparaty biologiczne, składające się przecież głównie z wody, zwyczajnie się zagotowują. Rekordowe rozdzielczości, na poziomie pojedynczych nanometrów, uzyskano dotychczas w trwalszych materiałach, np. defektach struktury krystalicznej – tzw. centrach barwnych – w diamencie.
Pytany o przyszłość mikroskopii, Hell mówi o niełatwym wyzwaniu: następnym krokiem powinny być techniki umożliwiające nieinwazyjne obrazowanie wnętrza tkanek, w tym ludzkich, z rozdzielczością na poziomie molekularnym.
Z kolei młodym badaczom radzi: patrzcie w niebo, stojąc mocno na ziemi. Ostrzega też przed zbytnią wiarą w teorie, które twierdzą, że wyjaśniają wszystko, gdyż często utrudniają one poszukiwanie innego, nieoczywistego rozwiązania problemu. Istotnie: teoria dyfrakcji, rozwinięta pod koniec XIX w., w niezwykle elegancki sposób, przy pomocy matematycznych formuł, tłumaczyła ograniczenie dyfrakcyjne. Należało jednak wyjść poza nią i spojrzeć raczej na zachowanie świecących cząsteczek barwników, opisywanych na gruncie – dość elementarnej zresztą – mechaniki kwantowej.
I na koniec rada dla naukowców, według noblisty, najważniejsza: pracować nad takimi zagadnieniami, które dają prawdziwą frajdę.
Korzystałem z wywiadu ze Stefanem Hellem przeprowadzonego przez Petera E. Andersena w 2013 r. oraz z materiałów Komitetu Noblowskiego.
DR HAB. PIOTR WASYLCZYK kieruje Pracownią Nanostruktur Fotonicznych na Wydziale Fizyki Uniwersytetu Warszawskiego, pracował również na Uniwersytecie w Oksfordzie i w laboratorium LENS we Florencji, był stypendystą FNP. Zajmuje się optyką nieliniową, pomiarami ultrakrótkich impulsów laserowych oraz wytwarzaniem i badaniem mikrostruktur o ciekawych właściwościach optycznych.
SUPERROZDZIELCZOŚĆ PO POLSKU
Prace nad mikroskopią STED od 2011 r. prowadzone są w Laboratorium Procesów Ultraszybkich na Wydziale Fizyki Uniwersytetu Warszawskiego. Pierwszy mikroskop, który pozwolił na uzyskanie rozdzielczości lepszej niż 100 nm – umożliwiającej np. bliższe przyjrzenie się budowie i funkcjom neuronów – zbudowała Joanna Oracz, wówczas magistrantka, laureatka m.in. konkursu „Dziewczyny Przyszłości. Śladami Marii Skłodowskiej-Curie” z 2010 r. Po dwuletnim stażu doktorskim w grupie Hella w Getyndze wróciła do Warszawy, gdzie będzie poszukiwała nowych, bardziej trwałych barwników do mikroskopii STED, opartych na materiałach nanostrukturalnych.
