Testy, testy, testy!

Tedros Ghebreyesus, dyrektor Światowej Organizacji Zdrowia (WHO), apelował niedawno do krajów dotkniętych koronawirusem SARS-CoV-2 o „testy, testy, testy!”. Według wielu ekspertów kluczowe dla pokonania pandemii COVID-19 jest szybkie wykrywanie chorych i zakażonych, by odizolować ich od zdrowej populacji i w miarę możliwości leczyć.

Jak wykryć niezauważalnego wroga, wielkości 90 nanometrów? Wirus zbudowany jest z otoczki białkowej i materiału genetycznego – w przypadku koronawirusów (zob. infografika) występuje on w postaci kwasu rybonukleinowego (RNA). Kiedy wirus łączy się z ludzką komórką, jego materiał genetyczny przedostaje się do jej wnętrza i manipuluje jej funkcjami. Wirusowe RNA zostaje odczytane przez specjalne komórkowe białka i w środku naszej własnej komórki powstają nowe cząstki wirusa. Po jakimś czasie doprowadzają one do śmierci komórki, a gdy ta się rozpada – są gotowe infekować kolejne. SARS-CoV-2 atakuje przede wszystkim nabłonki dróg oddechowych, wywołując chorobę o nazwie COVID-19, ale cząstki wirusa znajdowane są również w krwi i kale.

Dwa z trzech genów

Jedną z najpewniejszych metod wykrycia zakażenia koronawirusem SARS-CoV-2 jest znalezienie jego materiału genetycznego. Powszechnie stosuje się tzw. reakcję łańcuchową polimerazy z odwrotną transkrypcją (reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR). Takie testy zgodnie z obowiązującymi w Polsce wytycznymi należy wykonać u osób, które wykazują typowe dla infekcji koronawirusem objawy, oraz wobec których zachodzi epidemiologiczne prawdopodobieństwo kontaktu z osobą zarażoną. Najpierw jednak konieczne jest uzyskanie odpowiedniego materiału do badania. Ponieważ wirus atakuje drogi oddechowe, optymalnymi materiałami diagnostycznymi według WHO są wymaz z nosogardła, plwocina lub aspirat pobierany w trakcie bronchoskopii, czyli wprowadzenia specjalnego urządzenia do oskrzeli.

Najprostszy do uzyskania jest materiał z górnych dróg oddechowych. Za pomocą wsadzonego głęboko do nosa plastikowego patyczka z wiskozową końcówką pobiera się śluz i komórki nabłonka, licząc na to, że wśród nich znajdą się również cząstki wirusa. Pobraną próbkę należy w dalszej kolejności oczyścić i wyizolować wirusowy materiał genetyczny, którego w badanym materiale może być bardzo niewiele. Dlatego za pomocą odpowiednich metod biochemicznych trzeba go pomnożyć (amplifikować). W pierwszym kroku trzeba „przepisać” znalezione w próbce łańcuchy wirusowego RNA na odpowiadające im łańcuchy DNA – wykorzystując enzym zwany odwrotną transkryptazą. Dopiero tak zsyntetyzowane cząsteczki DNA można – w drugim kroku – namnażać za pomocą innego enzymu, nazywanego polimerazą.

Każdy etap reakcji przebiega w innej temperaturze, dlatego całość odbywa się w zautomatyzowanych termocyklerach, które na przemian podwyższają i obniżają temperaturę. W PCR często używana jest odporna na wysoką temperaturę polimeraza Taq, która pochodzi z ciepłolubnych bakterii, żyjących w gorących źródłach. Z jednej cząsteczki wirusowego RNA w ciągu kilkudziesięciu cykli PCR może powstać kilka miliardów kopii. Dzięki temu nawet niewielka ilość wirusa w pobranej próbce teoretycznie może dać wynik dodatni.

Metoda pozwala wykryć konkretne geny wirusa, np. fragmenty ORF1a, ORF1b i gen N. Dwa pierwsze odpowiadają za replikację wirusa w organizmie gospodarza, a gen N koduje białko budujące otoczkę wirusa. Badane geny mogą różnić się w zależności od producenta testu. W niektórych pracach opisywane jest także wykrywanie genu E, który koduje tzw. białko płaszcza. Do próbek dodaje się substancję, która emituje światło, jeśli gen zostanie wykryty: laboranci dowiadują się o wyniku dodatnim po prostu dzięki temu, że dana próbka świeci. Według WHO obecność dwóch z trzech poszukiwanych genów pozwala na potwierdzenie zakażenia nowym koronawirusem.

Czułość i swoistość

Gdy mowa o skuteczności testów diagnostycznych, kluczowe są dwa parametry: czułość i swoistość. Od nich zależy sens stosowania danego badania w praktyce.

W teście możemy uzyskać dwa wyniki: dodatni (np. potwierdzający obecność wirusa) i ujemny (brak wirusa). Każdy z tych wyników może być prawdziwy lub fałszywy. Mamy więc cztery możliwości. Wynik prawdziwie dodatni – osoba naprawdę chora jest uznana za chorą; fałszywie dodatni – osoba jest w rzeczywistości zdrowa, ale test mówi: „chora”. Wynik prawdziwie ujemny: osoba jest zdrowa i tak też mówi test; wynik fałszywie ujemny – test mówi: „zdrowa”, ale badany jest chory.

Czułość to stosunek wyników prawdziwie dodatnich do sumy wszystkich chorych. Parametr ten informuje nas więc, ilu chorych spośród wszystkich chorych rozpoznamy za pomocą danego testu. Wysoka czułość to jednak nie wszystko: wyobraźmy sobie test, który zawsze mówi: „chory”. Taki test miałby stuprocentową czułość, bo przecież każdy chory zostanie rzeczywiście uznany za chorego! Problem w tym, że każdy zdrowy otrzyma taką samą diagnozę. Tu wkracza swoistość: stosunek wyników prawdziwie ujemnych do wszystkich zdrowych. Jeśli przebadamy grupę zdrowych osób, to test o doskonałej swoistości powinien wszystkich określić jako zdrowi. Również i swoistość sama w sobie nie decyduje o jakości testu (łatwo sobie wyobrazić test, który zawsze mówi: „zdrowy” – test taki miałby stuprocentową swoistość) – podstawą przy ocenie konkretnego testu jest więc para czułość-swoistość.

Co to oznacza w praktyce? Jeśli otrzymamy dodatni wynik w badaniu o wysokiej swoistości, możemy być prawie pewni, że jesteśmy zakażeni. Jeśli zaś otrzymamy ujemny wynik w teście o dużej czułości, oznacza to, że najprawdopodobniej jesteśmy zdrowi.

RT-PCR można uznać za test swoisty, jednak nie musi on być aż tak bardzo czuły. Wiele zależy bowiem od samego pobrania próbki. Materiał nie może być niczym zanieczyszczony. Dodatkowo istotne jest miejsce pobrania. Kilka badań sugeruje, że lepiej wymaz pobrać z nosogardła niż z gardła środkowego (części ustnej gardła). Wytyczne mówią również, że jeśli to możliwe, najlepszy materiał do badań pochodzi z dolnych dróg oddechowych. Z danych wynika, że wirus w czasie infekcji zmienia swoje położenie. W zależności od etapu zakażenia i choroby wirus może znajdować się w górnych lub dolnych drogach oddechowych.

Dodatni wynik w badaniu RT-PCR (które ma wysoką swoistość) pozwala z bardzo dużym prawdopodobieństwem stwierdzić, że pacjent w momencie pobrania materiału z jego nosogardła był zainfekowany wirusem SARS-CoV-2. Ujemny wynik daje jedynie informację, że wirusa nie wykryto w wysłanej do badania próbce – mogło być choćby tak, że tego akurat dnia w tej akurat porcji śluzu nie znalazły się cząstki wirusa.

Badania krwi

Drugim elementem badania populacji pod kątem koronawirusa są testy wykrywające przeciwciała. Kiedy ludzki organizm spotyka na swojej drodze nieznany mu wcześniej patogen, komórki układu odpornościowego zwane limfocytami B produkują specjalne białka – przeciwciała – których zadaniem jest wiązanie się z powierzchnią chorobotwórczych patogenów. Przeciwciała są częścią tzw. adaptacyjnego układu odpornościowego, który przez całe życie „uczy się” rozpoznawania nowych patogenów. Białka te mogą być czasem obecne we krwi nawet wiele lat po infekcji, w czasie której zostały wytworzone. Badanie krwi może więc powiedzieć nam, z jakimi patogenami mieliśmy w przeszłości do czynienia.

Od niedawna na rynku dostępne są tzw. kasetkowe testy, przypominające zwykłe testy ciążowe. Wymagają jedynie kilku kropli krwi naniesionych na bibułę testu. Jeśli przeciwciała są w niej obecne, zostają wyłapane i tworzą widoczne gołym okiem kolorowe prążki. Oznacza to, że badany albo przeszedł, albo właśnie przechodzi (z objawami lub bez) koronawirusową infekcję.

Największą wadą tego typu testów jest brak możliwości rozróżnienia między aktywnym zakażeniem a przejściem infekcji w przeszłości. Obecnie nie wiadomo, jak przebiega odpowiedź układu immunologicznego w przypadku zachorowania na COVID-19, jak długo utrzymuje się odporność ani jak rozpoznać za pomocą przeciwciał trwające zakażenie. Wykrywając przeciwciała, znajdujemy jedynie ślad obecności patogenu w organizmie, a nie samego wirusa. Nie można też wykluczyć, że testy kasetkowe powodują reakcje krzyżowe z przeciwciałami przeciwko innym niż SARS-CoV-2 koronawirusom, na które jesteśmy stale narażeni.

Te wady szybkich testów badających przeciwciała stają się dla niektórych państw sporym problemem. Na początku kwietnia w brytyjskiej prasie pojawiła się informacja, że 3,5 mln testów zamówionych z Chin do niczego się nie nadaje. Institute of Biomedical Science podał, że jeden na dziesięciu przebadanych otrzyma wynik fałszywie dodatni. Po sprawdzeniu chińskich szybkich testów w Hiszpanii okazało się, że ich czułość wynosi jedynie 30 proc. W podobnej sytuacji znalazła się Słowacja.

Warto zaznaczyć jednak, że nie wszystkie testy wykrywające przeciwciała (testy serologiczne) są tak niefunkcjonalne. Wszystko zależy od producenta, transportu, odpowiedniego przechowywania i użytkowania. Dlatego poszukiwanie przeciwciał nie jest całkowicie pozbawione sensu. Takie testy, jeśli będą skuteczne i dobrze zinterpretowane, mogą dać epidemiologom rzeczywisty obraz pandemii.

Już teraz publikowane są wyniki badań prowadzonych wśród zdrowej populacji. W Nowym Jorku 3 tys. losowo wybranych osób przebadano za pomocą szybkich testów kasetkowych. U 13,9 proc. wykryto obecność przeciwciał. Podobne badanie przeprowadzono w Kalifornii. Tam wśród 3330 osób zrekrutowanych za pomocą reklam umieszczonych na Facebooku kontakt z SARS-CoV-2 miało zaledwie 1,5 proc. przebadanych, co po odpowiednim przeliczeniu dało 2,5-4,2 proc. zakażonej populacji w hrabstwie Santa Clara, gdzie przeprowadzono badanie. To pokazuje, że na obecnym etapie ekstrapolacja wyników tego typu regionalnych badań na całe społeczeństwo ma wątpliwą wartość. W dodatku takie prace obciążone są wieloma błędami.

Kalifornijskiemu badaniu zarzucano przykładowo, że zrekrutowane osoby mogły mieć objawy podobne do COVID-19 i chciały się przebadać, co miało szansę zwiększyć liczbę wyników dodatnich. W Nowym Jorku zaś badano osoby spotkane na ulicy, nie biorąc pod uwagę tych, którzy całkowicie ograniczyli wychodzenie z domu.

Odporność stadna

Dobrze skonstruowane badanie mogłoby dać rządzącym i ekspertom od zdrowia publicznego bardzo dużo informacji. Po pierwsze, jakie jest rzeczywiste zagrożenie związane z wirusem. Jeśli okazałoby się, że łączna liczba osób, które zetknęły się z SARS-CoV-2, jest dużo większa, niż wykrywamy to w testach RT-PCR, znacząco spadłaby nasza ocena śmiertelności COVID-19.

Drugą kwestią jest tzw. odporność stadna. Jeśli znaczny procent społeczeństwa przechoruje COVID-19 i zyska nabytą w wyniku kontaktu z wirusem odporność, ryzyko dalszego rozprzestrzeniania się SARS-CoV-2 będzie niewielkie. A to umożliwi powrót do normalnego życia. Jeśli odpowiednia większość jest odporna na wirusa, również osoby, które nie miały z nim kontaktu, będą bezpieczne. Badania serologiczne pozwolą ocenić, jaki poziom odporności stadnej osiągnęliśmy. Eksperci twierdzą, że minimalny odsetek osób z obecnymi we krwi przeciwciałami do zapewnienia stadnej odporności to około 70 proc. Jednak wciąż nie wiadomo, jak długo przeciwciała utrzymują się w organizmie. W określeniu tego testy serologiczne również są przydatne.

Prywatne laboratoria i niektóre firmy zaczynają oferować wykonanie testów serologicznych na zasadach komercyjnych. Każdy człowiek może zamówić domowy test lub wykonać go w laboratorium, nawet jeśli nie ma żadnych objawów. Ministerstwo Zdrowia podchodzi do takich działań sceptycznie. Również prof. Katarzyna Dzierżanowska-Fangrat, krajowa konsultant ds. mikrobiologii lekarskiej, uważa, że jedynym pewnym badaniem potwierdzającym zakażenie jest metoda genetyczna. Część polskich laboratoriów zrezygnowała z wykonywania testów serologicznych ze względu na duże ryzyko fałszywych wyników. Niektóre firmy oferują także komercyjnie metodę RT-PCR. W związku z tym Ministerstwo Zdrowia poinformowało, że każde laboratorium chcące oferować takie badania musi uzyskać walidację w Państwowym Zakładzie Higieny.

Prace nad kolejnymi testami i udoskonaleniem tych już stosowanych wciąż trwają. Badanie chorych i podejrzanych jest istotą skutecznej walki z chorobą, na którą nie ma specyficznego leku ani szczepionki. ©