Nożyczki już tną

Ta metoda już w 2012 r. została okrzyknięta przyszłym panaceum na setki chorób, ale jej zastosowania kliniczne pojawiły się dopiero niedawno. System CRISPR/Cas9 to rodzaj prostego mechanizmu odpornościowego niektórych bakterii, który chroni je przed atakami wirusów.

Przy pierwszym kontakcie bakterii z wirusem białka Cas9 wycinają fragment jego DNA – unieszkodliwiając w ten sposób intruza – a potem wklejają wycięty fragment w ściśle określone miejsce w genomie bakterii. „Biblioteczka” takich fragmentów nosi zaś nazwę CRISPR. To wspaniały wynalazek ewolucji, ponieważ wycięty fragment będzie działał jak pamięć immunologiczna bakterii – i jej potomstwa. Gdy zapamiętany w genomie bakterii wirus zaatakuje ponownie, zostanie rozpoznany i pocięty na kawałki.

Naukowców szczególnie zainteresował precyzyjny, wręcz chirurgicznie dokładny mechanizm działania „molekularnych nożyczek”. Bakteryjna maszyneria białkowa została w krótkim czasie zaadaptowana do pracy w komórkach ludzkich. W systemie kluczowe role odgrywają cząsteczka „przewodnika” RNA (ang. guide RNA – gRNA) i enzym Cas9. Cząsteczka gRNA kieruje enzym dokładnie w to miejsce, gdzie ma dojść do modyfikacji materiału genetycznego. Precyzja, z jaką system CRISPR/Cas9 odszukuje właściwe miejsce na nici DNA i je modyfikuje, spowodowała, że naukowcy od razu dostrzegli jego potencjał w leczeniu chorób o podłożu genetycznym. Zwłaszcza tych, gdzie zmiana na poziomie DNA jest niewielka, ale ma potężny wpływ na życie milionów ludzi, jak choćby w przypadku anemii sierpowatej czy mukowiscydozy.

Początki terapii genowej

W latach 90. XX w. podobnie wielkie nadzieje były pokładane w rozwoju konwencjonalnej terapii genowej, ale po początkowej fazie entuzjazmu zapanowało rozgoryczenie wywołane brakiem skuteczności i śmiercią pacjentów. Konwencjonalna terapia genowa polega na podaniu pacjentowi przy pomocy nośników wirusowych zdrowej kopii genu, który w jego organizmie nie działał prawidłowo. W czasach pandemii koronawirusa samo stwierdzenie o „nośniku wirusowym” brzmi być może niepokojąco, ale tak, w latach 90. XX w. wykorzystywano w tym celu najczęściej łagodne wirusy przeziębienia. A przynajmniej do czasu śmierci 18-letniego Jesse’ego Gelsingera, ochotnika w badaniu klinicznym w 1999 r.

Chłopak urodził się z mutacją w genie OTC, która powodowała niedobór jednego z produkowanych w wątrobie enzymów kluczowych w procesie degradacji białek w komórkach. Brak produktu genu OTC powoduje odkładanie amoniaku, który niszczy komórki, naczynia krwionośne i dociera nawet do mózgu, gdzie zabija neurony. Większość pacjentów umiera we wczesnym dzieciństwie, ale wariant mutacji u Jesse’ego prowadził do łagodnej formy choroby. Niemniej chłopak musiał dbać o dietę i przyjmować codziennie kilkadziesiąt tabletek, które regulowały poziom amoniaku. Według protokołu badania klinicznego, do którego zgłosił się jako ochotnik, do krwi pacjenta wprowadzano wirusa z poprawną kopią genu OTC, który miał dostać się do komórek wątroby, a następnie wbudować poprawny gen do ich DNA, co skutkowałoby produkcją funkcjonalnego enzymu OTC. Wirus wybrany jako nośnik dla genu uchodził za niegroźny, wywołujący jedynie lekkie przeziębienia. Terapia powiodła się już wcześniej u 17 pacjentów.

Jesse poczuł się źle od razu po podaniu wirusa, a jego stan z dnia na dzień się pogarszał – wysoka gorączka, uszkodzona wątroba, rozpad czerwonych krwinek, wreszcie uszkodzenie mózgu i śmierć. Przebieg terapii był szokiem dla lekarzy. Autopsja wykazała, że Jesse zetknął się wcześniej z zastosowanym wirusem podczas zwykłego przeziębienia. Kolejny kontakt wywołał gwałtowną reakcję układu odpornościowego. Można było to sprawdzić poprzez zbadanie obecności przeciwciał na ten typ wirusa we krwi chłopca, jednak tego nie zrobiono.

Śmierć Jesse’ego spowodowała wstrzymanie prac nad terapią genową na wiele lat i była lekcją pokory dla świata nauki. Ale naukowcy i lekarze odrobili lekcję z tego doświadczenia i teraz z większą ostrożnością podchodzą do bezpieczeństwa terapii opartych na modyfikacji genomu. Dobrym przykładem jest zaakceptowana w 2019 r. przez amerykańską Agencję Żywności i Leków terapia genowa w leczeniu rdzeniowego zaniku mięśni u dzieci (SMA), o której zrobiło się głośno ze względu na jej cenę – ponad dwa miliony dolarów – i organizowane publiczne zbiórki.

Zmodyfikowane limfocyty

W przypadku konwencjonalnej terapii genowej naukowcy nie mają w pełni kontroli nad obszarem DNA, w który zostanie wbudowany materiał genetyczny podany w wirusowym nośniku. Niesie to za sobą niebezpieczeństwo przerwania istotnych dla funkcjonowania komórek fragmentów DNA. Precyzja sytemu CRISPR/Cas9 niweluje w znacznym stopniu to zagrożenie, zmniejszając ryzyko niepożądanych efektów terapii. Obecnie wciąż trwają badania nad biochemicznym mechanizmem działania „molekularnych nożyczek”, jednak świat nauki mówi również „sprawdzam” – i dochodzi do pierwszych testów na ludziach.

Pierwsze doniesienia o próbach klinicznych z zastosowaniem techniki CRISPR/Cas9 dotarły do nas w 2016 r. z Chin. Naukowcy ogłosili wtedy zastosowanie tej metody edycji genów w terapii nowotworów. W limfocytach T pobranych z krwi pacjentów cierpiących na raka płuc usunięto gen kodujący białko PD-1, które hamuje odpowiedź immunologiczną, na czym korzystają komórki nowotworowe. Nie są one wówczas eliminowane z organizmu i mogą się namnażać.

Następnie zmodyfikowane molekuły podano tym samym pacjentom. Limfocyty T z usuniętym białkiem PD-1 powinny szybciej i efektywniej atakować i niszczyć komórki nowotworowe. W badaniu miało wziąć udział 250 pacjentów, ale bardzo mało danych zostało do tej pory opublikowanych, więc nie wiemy, czy technika okazała się skuteczna.

W immunoterapii nowotworów testowane są w laboratoriach rozwiązania, które łączą edycję genomu metodą ­CRISPR/Cas9 (ukierunkowaną na pozbycie się wspomnianego białka PD-1 z limfocytów T) z tzw. techniką CAR-T. Przy jej pomocy limfocyty są tak modyfikowane, by mogły rozpoznawać komórki nowotworowe pacjenta. Połączenie obu metod daje szansę na otrzymanie efektywnie działających komórek odpornościowych, zdolnych do szybkiego i skutecznego zwalczania nowotworu. Edycja materiału genetycznego pobranych od pacjenta limfocytów T zachodzi pozaustrojowo. Komórki są następnie namnażane i podawane pacjentowi. Przewiduje się, że w kolejnych latach będzie rosła liczba tego typu badań klinicznych. Już teraz tylko dla samej techniki ­CAR-T jest ich zarejestrowanych ponad 500 na całym świecie.

Hemoglobina płodowa u dorosłych

Zdecydowanie większe nadzieje z zastosowaniem metody CRISPR/Cas9 są pokładane w terapii chorób o podłożu genetycznym. W USA prowadzone są badania kliniczne nad zastosowaniem edycji genów w leczeniu anemii sierpowatej i beta-talasemii. W przypadku obu tych chorób dochodzi do mutacji w obrębie genu kodującego hemoglobinę – białko odpowiadające za transport tlenu w organizmie.

U części osób posiadających wady genetyczne związane z anemią sierpowatą lub beta-talasemią nie pojawiają się jednak objawy choroby – jednocześnie zaobserwowano u nich występowanie w czerwonych krwinkach tzw. hemoglobiny płodowej. Badania wykazały, że u osób tych występuje mutacja w genie odpowiedzialnym za produkcję tego rodzaju hemoglobiny. Hemoglobina płodowa wykazuje silniejsze powinowactwo do tlenu, dzięki czemu może odbierać tlen związany z hemoglobiną w krwi matki, docierającej do łożyska. Normalnie ten rodzaj hemoglobiny przestaje być produkowany około szóstego miesiąca życia – chyba że dojdzie do wspomnianej mutacji. Zjawisko to opisywane jest jako zespół wrodzonego przetrwania hemoglobiny płodowej i nie ma negatywnych skutków dla zdrowia. Firmy Vertex Pharmaceuticals i CRISPR Therapeutics testują, czy przy pomocy edycji genów można wprowadzić mutację utrzymującą produkcję hemoglobiny płodowej w dorosłym życiu i tym samym pomóc pacjentom z anemią sierpowatą i beta-talasemią.

Terapia polega na pobraniu od pacjenta komórek macierzystych krwi obecnych w szpiku, które są modyfikowane genetycznie w laboratorium za pomocą techniki CRISPR/Cas9, tak żeby produkować duże ilości hemoglobiny płodowej. Następnie te same komórki po namnożeniu są ponownie wprowadzone do organizmu pacjenta – teraz już uzbrojone w nowe możliwości. Dostarczają do krwi hemoglobinę płodową i w ten sposób zapewniają lepsze utlenowanie krwi, a co za tym idzie, wszystkich tkanek. Badania przedkliniczne wykazały, że w ok. 90 proc. komórek macierzystych krwi dochodzi do pożądanej zmiany w DNA, co skutkuje wzrostem produkcji hemoglobiny płodowej, tak że stanowi ona nawet przeszło 40 proc. całej hemoglobiny. Według naukowców ma to wystarczyć dla poprawy stanu zdrowia pacjentów. Badania wykazały również, że modyfikacja DNA nie zachodzi w przypadkowych miejscach, co ma kluczowe znaczenie dla bezpieczeństwa terapii. Obecnie terapia pod nazwą CTX001 znajduje się na etapie prób klinicznych u pierwszych pacjentów z ciężką postacią anemii sierpowatej w USA, Kanadzie, Belgii, Niemczech i Włoszech.

Terapia w organizmie

Komórki krwi – takie jak limfocyty T czy erytrocyty zawierające hemoglobinę – można łatwo pobrać od pacjenta i „naprawić” w laboratorium. Inaczej jest w przypadku, gdy choroba dotyka całego organizmu albo wybranego organu. Naukowcy ciągle pracują nad rozpoznaniem możliwości skutecznej i bezpiecznej edycji genów systemem CRISPR/Cas9 na poziomie całego organizmu. Jedno z takich badań dotyczy leczenia wrodzonej ślepoty Lebera.

Jest to choroba o podłożu genetycznym, w której dochodzi do mutacji genu CEP290, powodującej obumieranie jednego rodzaju fotoreceptorów – pręcików – w siatkówce oka. Komórki te nie potrafią się zregenerować i następuje stopniowa utrata wzroku. Badanie kliniczne prowadzone wspólnie przez firmy Editas Medicine i Allergan ma sprawdzić, czy możliwe jest wprowadzenie we wnętrzu cząsteczki wirusa systemu ­CRISPR/Cas9 do komórek oka i usunięcie na miejscu mutacji w genie CEP290. Badanie kliniczne o chwytliwej nazwie „Brilliance” (blask) jest pierwszym na świecie, w ramach którego testuje się medycynę opartą na edycji genów bezpośrednio w organizmie człowieka.

Pierwszymi osobami, które zostaną poddane eksperymentalnej terapii, są dorośli pacjenci z prawie całkowitą ślepotą, ale naukowcy nie wykluczają też testów u dzieci. Początkowo małe ilości „molekularnych nożyczek” zostaną wstrzyknięte pod siatkówkę w celu określenia bezpiecznej dawki. Na tym etapie naukowcy nie będą jeszcze oceniać efektywności leczenia. Jeżeli terapia okaże się bezpieczna, ochotnicy otrzymają wyższe dawki, a lekarze będą obserwować, czy zachodzi poprawa widzenia u pacjentów.

W opisanym badaniu naukowcy wykorzystują wirusy do zapakowania maszynerii CRISPR/Cas9 i dostarczenia jej w miejsce działania. Ale wirusy mają stosunkowo niewielką pojemność, co może stanowić barierę dla niektórych terapii, a poza tym mogą wpływać na jej bezpieczeństwo – jak w przypadku konwencjonalnej terapii genowej. Dlatego naukowcy z firm Intellia i szwajcarskiego giganta farmaceutycznego Novartis chcą opracować lipidowe nanocząstki, do których można zmieścić system CRISPR/Cas9 i bezpiecznie przetransportować go wraz z krwią do komórek docelowych. Nośniki oparte na lipidach mają również tę zaletę, że łatwo dochodzi do ich połączenia się z błoną komórkową, również zbudowaną w znacznej mierze z lipidów. Badania wykazują, że takie nanocząstki mają tendencję do gromadzenia się w wątrobie, dlatego naukowcy chcą się najpierw skoncentrować na terapiach w obrębie tego organu. Równocześnie będą pracować nad wprowadzaniem nanocząstek do innych organów, takich jak mięśnie czy mózg.

Rozcinanie koronawirusa

Badań nad zastosowaniem technologii CRISPR/Cas9 nie mogło także zabraknąć w obszarze zwalczania koronawirusa SARS-CoV-2. Naukowcy z Uniwersytetu Stanforda już jakiś czas temu rozpoczęli prace nad wykorzystaniem tej metody w leczeniu zwykłej grypy, ale w obliczu pandemii przekierowali swoje wysiłki w kierunku opracowania terapii na infekcję nowym koronawirusem. Innowacyjna metoda bazująca na technice ­CRISPR/Cas9 została nazwana PAC-MAN (ang. Prophylactic Antiviral CRISPR in huMAN cells, czyli „profilaktyczny antywirusowy CRISPR dla ludzkich komórek”). Skojarzenie z popularną grą komputerową nie jest przypadkowe.

System PAC-MAN oparty jest na enzymie Cas13 i cząsteczce gRNA, która kieruje Cas13 w odpowiednie miejsce w genomie wirusa. PAC-MAN wprowadza zmiany w materiale genetycznym koronawirusa, w wyniku czego dochodzi do jego neutralizacji i zahamowania namnażania w komórkach. Obecnie prowadzone są prace nad tym, żeby terapia mogła skutecznie dotrzeć do płuc pacjenta zakażonego SARS-Cov-2, co nie jest takie proste, biorąc pod uwagę znaczne zniszczenia tkanek, proces zapalny i wypełnienie zainfekowanych płuc płynem.

W tym celu naukowcy z Uniwersytetu Stanforda połączyli siły z laboratorium Molecular Foundry również zlokalizowanym w Kalifornii, gdzie prowadzone są prace nad lipitoidami, syntetycznymi nanocząsteczkami odkrytymi 20 lat temu. Lipitoidy mają szerokość jednej miliardowej metra, nie są toksyczne dla człowieka i łatwo można w nich upakować system PAC-MAN. Pod koniec kwietnia przeprowadzono pierwsze eksperymenty wykorzystujące Lipitoid-1, który łączy elementy składowe systemu PAC-MAN, w próbce ludzkich komórek nabłonkowych płuc. Wykazano, że ingerencja ta aż o 90 proc. zmniejszyła liczbę cząsteczek wirusa SARS-CoV-2. Wyniki tych prac są obiecujące, ale przed naukowcami jeszcze bardzo długa droga, zanim będą mogły stać się skuteczną i bezpieczną terapią antywirusową.

Reputacja techniki CRISPR/Cas9 została kilka lat temu nadszarpnięta z uwagi na badania chińskich naukowców idące w kierunku edytowania materiału genetycznego ludzkich embrionów, co jest kwestionowane pod względem bioetycznym. Prowadzone obecnie badania kliniczne nie są podważane pod tym względem, ponieważ edycja DNA przy pomocy „molekularnych nożyczek” dotyczy osób dorosłych, a wprowadzane zmiany nie mogą być dziedziczone (ponieważ dotyczą komórek somatycznych, a nie rozrodczych). Postępy w wielu terapiach są bardzo szybkie i obiecujące, zwłaszcza że od odkrycia systemu ­CRISPR/Cas9 nie minęła jeszcze dekada. W tym krótkim czasie edycja genów zrewolucjonizowała biologię molekularną i pozwoliła na szybki rozwój medycyny precyzyjnej. ©

NOWA DROGA: EDYCJA mRNA

METODY EDYCJI GENÓW nie muszą opierać się wyłącznie na trwałej modyfikacji łańcuchów DNA – jak w przypadku systemu CRISPR/Cas9. Obecnie na znaczeniu zyskuje metoda edycji mRNA, odkryta w podobnym czasie co CRISPR/Cas9 i przez lata zostająca w jego cieniu; mRNA to robocza, jednoniciowa kopia DNA, na bazie której w komórkach syntetyzowane są białka. Ponieważ po spełnieniu swojej funkcji jest usuwana, edytowanie mRNA niesie za sobą mniejsze zagrożenia niż edycja DNA – obecnego stale w jądrze komórkowym. Dzięki tej metodzie pojawiły się szanse na opracowanie nowych terapii na raka, choroby genetyczne, leczenie przewlekłego bólu czy obniżanie poziomu cholesterolu.

Edycja mRNA opiera się na aktywności dwóch enzymów odkrytych w ludzkich komórkach: ADAR i APOBEC. Każdy z nich może dokonywać pojedynczego rodzaju zmian w łańcuchu mRNA. Jest to pewnym ograniczeniem w porównaniu do CRISPR/Cas9, gdzie występuje większa swoboda w rodzaju dokonywanych zmian. Z drugiej strony oba enzymy są pochodzenia ludzkiego, więc nie niosą ze sobą zagrożenia aktywacji układu odpornościowego, tak jak w przypadku bakteryjnego białka Cas9.

Naukowcy z Marine Biological Laboratory w Massachusetts pracują nad terapią przeciwbólową bazującą na edycji mRNA genu kodującego kanał sodowy o nazwie Nav1.7, który kontroluje przekaz sygnałów bólowych do mózgu. Trwała zmiana genu Nav1.7 mogłaby wyeliminować uczucie bólu i dodatkowo wpłynąć na funkcjonowanie układu nerwowego. Ale obniżenie jego poziomu w wybranych tkankach i przez określony czas – właśnie poprzez edycję mRNA, a nie DNA – pozwoliłoby uśmierzyć ból bez ryzyka związanego ze stosowaniem standardowych leków przeciwbólowych (które np. mogą uzależniać). Metodę tę bada się też w kontekście regulacji poziomu cholesterolu. Wykazano, że osoby z określonymi mutacjami w genie PCSK9 mają obniżony poziom cholesterolu we krwi. Wystarczyłoby odpowiednio edytować sekwencję mRNA, żeby osiągnąć podobny efekt u pacjentów z nadmierną ilością cholesterolu.

Podobnie jak w przypadku CRISPR/Cas9, jednym z głównych wyzwań stojących przed naukowcami jest skuteczne i bezpieczne wprowadzenie zestawu enzymów koniecznych do edycji mRNA do komórek w organizmie. W tym celu prowadzone są testy przy użyciu zarówno nośników wirusowych, jak i nanocząstek. © AB