Małpy z probówki

14 lutego minęła piętnasta rocznica śmierci owcy Dolly. Została sklonowana i przeżyła aż sześć i pół roku (ponad połowę z tego, ile dożywają przeciętne owce). Ta najbardziej znana przedstawicielka tego sympatycznego gatunku narodziła się niedaleko Edynburga, jednak nie na szkockim wrzosowisku, ale pod okiem naukowców w Instytucie Roslin. Z tą rocznicą zbiegła się informacja podana do światowych mediów przez chińskich naukowców o narodzinach dwóch makaków: Zhong Zhong i Hua Hua (powyżej na zdjęciu), sklonowanych przy wykorzystaniu tej samej metody co owca Dolly.

Makaki należą do rzędu naczelnych, tak jak my, więc potencjalnie została przekroczona kolejna granica w kierunku klonowania człowieka. Na razie Zhong Zhong i Hua Hua piją mleko z butelki i wesoło harcują w sterylnym kojcu w Instytucie Neurobiologii Chińskiej Akademii Nauk w Szanghaju, nie zdając sobie sprawy, że ich zabawy zostały pokazane we wszystkich telewizjach świata. Imiona nowo narodzonych makaków są symboliczne, pochodzą od chińskiego słowa Zhonghua, które oznacza chiński naród lub ludzi. Ma to niewątpliwie podkreślić sukces naukowców z Państwa Środka.

Transfer jądra

Do sklonowania makaków wykorzystano metodę transferu jądra komórkowego. Najpierw z komórki jajowej usunięto jądro (posiadające pojedynczy zestaw chromosomów), a następnie wszczepiono do niej jądro pobrane z komórki somatycznej (o pełnym, podwójnym zestawie chromosomów). W ten sposób powstał zarodek, który wszczepiono do macicy matki zastępczej, gdzie rozwijał się płód.

Dolly została sklonowana przy pomocy materiału genetycznego pochodzącego z komórek gruczołu mlekowego innej dorosłej owcy. W przypadku Zhong Zhong i Hua Hua jądra komórkowe pochodziły z fibroblastów, czyli komórek budujących tkankę łączną. Okazało się, że w przypadku makaków procedura ta jest bardzo skomplikowana.

Naukowcy napotkali wiele trudności, kiedy chcieli przeprowadzić klonowanie przy wykorzystaniu materiału genetycznego pochodzącego z organizmów dorosłych makaków. Wszystkie takie próby zakończyły się niepowodzeniem: z 290 komórek jajowych powstały 192 zarodki, z których 181 zostało wszczepionych do 42 matek zastępczych. Rozwinęły się 22 ciąże, ale urodziły się tylko dwa makaki, które przeżyły zaledwie 30 godzin i zmarły z powodu niewydolności oddechowej.

Potrzebne było alternatywne źródło materiału genetycznego. Jądra komórkowe zostały pobrane z fibroblastów pochodzących z płodów makaków. Główny autor artykułu opublikowanego w prestiżowym magazynie „Cell”, Zhen Liu, spędził ponad 3 lata na udoskonalaniu procedury transferu jądra do komórki jajowej naczelnych. Po jej wstępnej optymalizacji udało się otrzymać 79 prawidłowo rozwijających się zarodków, z których 21 wszczepiono matkom zastępczym. W efekcie rozwinęło się z nich sześć ciąż, a na świat przyszły do tej pory dwa makaki, których rozwój możemy teraz obserwować. Naukowcy liczą, że w niedługim czasie narodzą się kolejne klony. Te liczby uświadamiają nam jednak, jak wiele jeszcze trzeba zrobić, by metoda była bardziej bezpieczna i efektywna.

Manipulacje ludzkim włosem

Metoda transferu jądra komórkowego została spopularyzowana dzięki klonowaniu owcy Dolly, ale pionierskie badania nad nią sięgają początków XX wieku. Prekursorem tej techniki był niemiecki zoolog Hans Spemann, który prowadził badania na płazach – salamandrach. W pierwszym doświadczeniu przeprowadzonym w 1902 r. udało mu się rozdzielić, przy pomocy pętli zrobionej z ludzkiego włosa, zarodek składający się z dwóch komórek, czyli po pierwszym podziale od zapłodnienia, na dwie oddzielne komórki (podobny proces zachodzi naturalnie w przypadku ciąży bliźniaczej jednojajowej). Z każdej z nich rozwinęła się zdrowa salamandra. Spemann próbował powtórzyć to doświadczenie na późniejszych etapach rozwoju zarodka płaza, ale bez powodzenia.

Do podobnych doświadczeń na zarodkach salamander Spemann powrócił w 1928 r. i również posłużył się ludzkim włosem jako kluczowym przyrządem. Tym razem przy pomocy pętelki zaplecionej z włosa przepchnął jądro komórkowe do części cytoplazmy zapłodnionej komórki jajowej, oddzielając je od pozostałej części komórki. Pętelka była utrzymywana podczas kolejnych podziałów komórkowych, które zachodziły tylko w tej części, gdzie znajdowało się jądro komórkowe. Po czterech podziałach komórkowych, z których powstało 16 komórek, Spemann poluzował pętelkę tak, że jądro mogło przemigrować do pozostałej części cytoplazmy. A następnie znowu ją zacisnął i tę pojedynczą komórkę oddzielił od reszty zarodka. Co ciekawe, zarówno 16-komórkowy zarodek, jak i pojedyncza komórka ulegały dalszym podziałom komórkowym i w końcu rozwinęły się z nich zdrowe salamandry. Można przyjąć, że eksperyment Spemanna był pierwszą udaną próbą transferu jądra komórkowego. Pionierskie badania Hansa Spemanna zostały docenione przez Szwedzką Akademię Nauk – w 1935 r. uczony z Fryburga Bryzgowijskiego został nagrodzony Nagrodą Nobla.

Mimo to, powszechnie przypisuje się pierwsze klonowanie przy pomocy transferu jądra amerykańskim biologom: Robertowi Briggsowi i Thomasowi Kingowi, którzy dzięki tej metodzie, w 1952 r., sklonowali żabę. Wykonali oni wiele eksperymentów i testowali jądra komórkowe pochodzące z komórek na różnym etapie rozwoju. Ich doświadczenia były niezwykle cenne dla całej embriologii. Prace tych naukowców potwierdziły, że to jądro komórkowe steruje rozwojem organizmu, oraz że klonowanie ma większe szanse powodzenia, gdy jądro komórkowe pochodzi z komórek na wczesnym etapie rozwoju zarodkowego.

Przeprogramowanie DNA

Dlaczego klonowanie przy pomocy techniki transferu jądra komórkowego jest takim wyzwaniem technicznym? Klonowanie charakteryzuje się bardzo niską efektywnością i dużym ryzykiem powstawania wad rozwojowych. Obecnie szacuje się, że na 100 wygenerowanych zarodków urodzi się tylko 0-10 klonów. Trudność polega na tym, że materiał genetyczny pochodzący z ciała dorosłego organizmu jest już zaprogramowany tak, iż komórka dawcy pełni określoną funkcję. Dochodzi w niej do ekspresji (ujawniania się) określonych genów, z kolei inne ulegają wyciszeniu. W procesie klonowania musi dojść do „przeprogramowania” zgromadzonego w jądrze materiału genetycznego i niejako cofnięcia się w rozwoju do początkowych etapów powstawania organizmu. Jak to przeprogramowanie zachodzi?

DNA podlega modyfikacji polegającej na dołączaniu jednowęglowych grup metylowych – tzw. metylacji. Proces ten reguluje, które geny ujawniają się w określonych komórkach – dzięki temu, mimo takiego samego materiału genetycznego, jedne komórki rozwijają się np. w neurony, a inne – w komórki skóry. Materiał genetyczny pochodzący z komórki dawcy ma już określony wzór metylacji, charakterystyczny dla tkanki, z której pochodzi. Ten wzór musi zostać wymazany w procesie przeprogramowania. W tym celu stosuje się środki chemiczne takie jak trichostatyna A czy 5-deoxy-azacytydyna. Naukowcy z Szanghaju zastosowali właśnie trichostatynę A w połączeniu z ludzkim enzymem Kdm4d, który dodatkowo wsparł usuwanie grup metylowych z DNA wprowadzonego do komórki jajowej. Dopiero takie połączenie czynników ułatwiających przeprogramowanie DNA doprowadziło do sukcesu. Po wszczepieniu materiału genetycznego do komórki jajowej biorcy, DNA uległo ponownie metylacji, ale w sposób, który umożliwiał ekspresję genów odpowiedzialnych za rozwój nowego organizmu.

Rażenie błony prądem

Pierwsze próby klonowania z wykorzystaniem materiału genetycznego pobranego od dorosłego organizmu przeprowadził brytyjski embriolog John Gurdon w 1958 r.

Modelem eksperymentalnym, tak jak u Briggsa i Kinga, była żaba. Gurdon pobrał jądro z komórki jelita kijanki i wszczepił je do pozbawionej jądra komórki jajowej. W ten sposób powstały kijanki, które były genetycznie identyczne z dawczynią jądra komórkowego. Ten eksperyment udowodnił, że materiał genetyczny pobrany z somatycznej komórki, która wchodzi w skład wyspecjalizowanego organu, ­jakim są ­jelita, posiada cały „przepis na życie” konieczny do przeprowadzenia klonowania. Eksperymenty Gurdona były także kluczowe w badaniach nad komórkami macierzystymi. Po raz pierwszy pokazano, że dojrzałą komórkę, o określonej lokalizacji i funkcji, można przeprogramować w komórkę macierzystą – czyli taką, z której może rozwinąć się dowolna specjalistyczna komórka. Za te badania John Gurdon odebrał w 2012 r. Nagrodę Nobla, razem z japońskim lekarzem Shin’ya Yamanaką.

W kolejnych latach naukowcy czynili systematyczne postępy w doskonaleniu metody klonowania. Krokiem milowym było stworzenie pierwszego klonu ssaka przy pomocy techniki transferu jądra.

W 1984 r. Steen Willadsen powołał w ten sposób do życia owcę. Jako źródło materiału genetycznego naukowiec wykorzystał ośmiokomórkowy zarodek, z którego wyodrębnił jedną komórkę i przy użyciu prądu elektrycznego dokonał fuzji z pozbawioną jądra komórką jajową (prąd powoduje dziurawienie błony komórkowej, przez co łatwiej połączyć z sobą dwie komórki). Komórki jajowe ssaków są dużo mniejsze niż żab czy salamander. Dlatego wszelkie manipulacje są dużo trudniejsze, muszą odbywać się pod mikroskopem i ludzki włos nie nadaje się do zastosowania.

Zaledwie 12 lat później, w Roslin, Ian Wilmut i Keith Campbell sklonowali owcę Dolly. A w 1999 r. w Oregonie na świat przyszła pierwsza sklonowana przedstawicielka naczelnych – rezus (małpa z rodziny makakowatych) o imieniu Tetra. W tym przypadku zastosowano metodę testowaną we wczesnych latach 20. przez Spemanna na salamandrach, czyli podział jednego zarodka na dwa na odpowiednio wczesnym etapie rozwoju. Powstała w ten sposób ciąża bliźniacza dała początek dwóm identycznym organizmom. Jest to dużo łatwiejsza metoda niż technika transferu jądra, dlatego trzeba było czekać prawie 20 lat, aż na świat przyjdą klony naczelnych z materiałem genetycznym pochodzącym z komórek somatycznych.

Medyczne nadzieje

Naukowcy z Szanghaju publicznie podkreślają, że ich eksperymenty na małpach są w pełni zgodne z regułami bioetycznymi. Pracownicy laboratorium, w którym powstały sklonowane makaki, postępują zgodnie z regułami badań na zwierzętach ustanowionymi przez amerykański Narodowy Instytut Zdrowia.

Genom makaka został zsekwencjonowany, a przeprowadzona analiza porównawcza z genomem człowieka wykazała aż 97,5 proc. identyczności. Chińscy naukowcy zdecydowanie twierdzą, że ich intencją nie jest taka optymalizacja metody klonowania naczelnych, by w krótkim czasie stało się możliwe klonowanie człowieka. Podkreślają jednak, że liczą, iż ich badania uświadomią światowym decydentom, jak ważne jest uregulowanie przepisów prawnych dotyczących klonowania.

Technika klonowania w połączeniu z metodami edycji genów może prowadzić do powstania organizmów identycznych genetycznie, z wyjątkiem jednego konkretnego genu odpowiedzialnego za rozwój danej choroby. Dlatego osiągnięcia naukowców z Szanghaju mogą pomóc w lepszym zrozumieniu wielu ludzkich chorób, począwszy od nieprawidłowości genetycznych, przez nowotwory, aż po stosunkowo mało poznane zaburzenia neurodegeneracyjne, takie jak choroby Alzheimera, Parkinsona czy Huntingtona. ©

Autorka jest doktorem biologii i popularyzatorką nauki, prowadziła badania m.in. w Instytucie Biochemii Maxa Plancka w Monachium, Europejskim Laboratorium Biologii Molekularnej w Heidelbergu oraz w Międzynarodowym Instytucie Biologii Molekularnej i Komórkowej w Warszawie. Stale współpracuje z „Tygodnikiem”.

Wskrzeszanie gatunków

W 1993 roku, czyli jeszcze zanim narodziła się owca Dolly, Steven Spielberg wprowadził temat klonowania do popkultury dzięki filmowi „Jurassic Park”. Tyrannosaurus Rex i inne dinozaury ożyły dzięki zapałowi szalonych naukowców, którzy wykorzystali do klonowania DNA gadów zachowane w jelitach komarów uwięzionych w bursztynie. Żeby kontrolować populację dinozaurów i nie dopuścić do niekontrolowanego rozmnażania, wszystkie okazy zamieszkujące park były samicami. W realnym świecie nie ma planów na klonowanie jurajskich gadów, ale mamutów już tak. Zespół naukowców z Japonii i Rosji od wielu lat pracuje nad wyizolowaniem materiału genetycznego z dobrze zachowanych zwłok mamuta i wprowadzeniem go do komórki jajowej pobranej od afrykańskiej słonicy. Na razie wszelkie próby kończą się niepowodzeniem ze względu na wysoki stopień degradacji DNA mamuta. Do tej pory jedynym sklonowanym wymarłym zwierzęciem jest koziorożec pirenejski. Przeżył tylko jeden dzień i zmarł na skutek ciężkiego defektu płuc. Ożywianie wymarłych zwierząt na dużą skalę to wciąż raczej science fiction, ale część naukowców upatruje w klonowaniu szansę dla wielu gatunków zwierząt, które obecnie są zagrożone wyginięciem i mają trudności z rozmnażaniem się w ogrodach zoologicznych. ©
AB